高中生物学实验中的物质鉴定方法归纳

秦四哥

在高中生物学实验中，学生对于各种物质鉴定所用试剂的选择和应用只是强性记忆，没有理解，更没有形成系统性知识，因此常常出现错误。为此，本文参考了高中生物学教材中相关物质鉴定的分类方法，从试剂的配置、使用方法、实验现象和作用原理等方面对高中生物学实验中的物质鉴定方法进行了归纳和整理(表1)。

                              

1糖类鉴定用的试剂

1.1斐林试剂常用于鉴定还原糖。

1.1.1配置方法

试剂甲液（0.lg/mL的NaOH溶液）：将125g氢氧化钠和137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中。试剂乙液（0.05g/mL的CuS04溶液），将34.5g结晶硫酸铜溶于500mL水中，加0.5mL硫酸，混合均匀。

1.1.2使用方法

使用时现配现用，将试剂甲与试剂乙等量混合均匀后加入待测溶液，并进行水浴加热。

1.1.3实验现象

鉴定可溶性还原糖，出现的颜色变化为：浅蓝色→棕色→砖红色。因为待测液刚加入配制的斐林试剂，溶液是浅蓝色。水浴加热一段时间后，还原产生部分砖红色的Cu2O，此时溶液呈现两种颜色的混合色即棕色。随着反应的进行，砖红色的Cu2O逐渐增多，溶液呈砖红色。

1.1.4作用原理

甲液和乙液混合后产生Cu(OH)2悬浊液，在加热条件下，能够被可溶性还原糖中的还原性基团醛基还原成砖红色Cu20沉淀。如果直接用火焰加热则会因为产生黑色的CuO而影响实验现象的观察。如果斐林试剂放置一段时间，Cu(OH)2会沉淀在溶液底部而无法使用。甲液和乙液也不可分别加入到待测液中。否则，待测液中的有机酸会中和NaOH，从而影响鉴定。

1.2班氏试剂常用于鉴定尿糖。

1.2.1配置方法

先在400mL水中加85g柠檬酸钠和50g无水碳酸钠；同时在50mL加热的水中加入8.5g无水硫酸铜，制成CuS04溶液。然后把CuS04溶液倒入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅，如产生沉淀可滤去。

1.2.2使用方法

在试管中加入待测尿液0.lmL，加入班氏试剂lmL，混合均匀后，将试管放入盛有开水的烧杯中，加热煮沸1~2min。

1.2.3实验现象

在尿糖的鉴定中，出现的颜色变化为：浅蓝色→砖红色。因为待测液刚加入班氏试剂，溶液是浅蓝色。水浴加热一段时间后，还原产生砖红色的氧化亚铜。

1.2.4作用原理

班氏试剂配置中柠檬酸钠和碳酸钠均为强碱弱酸盐，在水中它们均可水解产生OH-，当柠檬酸钠-碳酸钠溶液和CuS04溶液混合时，Cu2+和OH-结合，生成Cu(OH)2与葡萄糖中的醛基反应生成砖红色沉淀。此外柠檬酸钠-碳酸钠为一对缓冲物质，产生的数量有限，与溶液混合后产生的浓度相对较低，不易析出，因此该试剂可长期保存

1.3碘液碘液常用于检测淀粉。

1.3.1配制方法

称取13g碘及35g碘化钾，溶于100mL水中，稀释定容至1000mL，摇匀，贮存于棕色瓶中。

1.3.2使用方法

在试管中加入待测样液2mL，或将待测材料切成薄片后滴加碘液后观察颜色变化。

1.3.3实验现象

直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫色，糊精遇碘呈红色。

1.3.4作用原理

淀粉是由10%~30%的直链淀粉和70%~90%的支链淀粉组成。直链淀粉具有遇碘变蓝的特性，因为溶于水的直链淀粉借助分子内的氢键卷曲成螺旋状。如果在淀粉液中加入碘液，碘分子便嵌入到螺旋结钩的空隙处，并且借助范德华力与直链淀粉联系在一起，形成了一种络合物，这种络合物能够反射的光是蓝光，所以使淀粉溶液呈现出蓝色来。淀粉跟碘生成的络合物的颜色，跟淀粉的聚合度有关。在一定范围内，随聚合度的增加，络合物的颜色会发生变化。例如，直链淀粉的聚合度高，络合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链聚合度低些，形成的络合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显红色等。淀粉与碘生成的络合物在pH=4时最稳定，所以显色反应在微酸性溶液里最明显。

2蛋白质鉴定用试剂

常用双缩脲试剂鉴定蛋白质。

2.1配置方法

试剂A（0.lg/mL的NaOH溶液）：配置方法同斐林试剂的甲液，配好后贮于带橡皮塞的瓶中。试剂B（0.01g/mL的CuSO4溶液）。可取斐林试剂乙液（0.05g/mLCuSO4溶液）lmL加4mL水稀释，即成为试剂B（0.01g/mLCuSO4溶液）。

2.2使用方法

先将双缩脲试剂A加入组织样液，摇荡均匀。然后再滴加双缩脲试剂B，摇荡均匀，观察颜色变化。

2.3实验现象

双缩脲试剂鉴定蛋白质，出现的颜色变化为：无色→浅蓝色→紫色。因为加入双缩脲试剂A液，溶液无色；再加入双缩脲试剂B液，先有Cu(OH)2形成，溶液呈浅蓝色；振荡均匀后，反应完成，溶液呈紫色。

2.4作用原理

双缩脲试剂的名称来自双缩脲的合成和化学性质：把尿素加热至180℃时，2个分子尿素缩去1个分子氨，生成1分子双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与少量的硫酸铜溶液作用，形成紫色络合物。故0.lg/mLNaOH溶液和0.Olg/mL硫酸铜溶液称为双缩脲试剂。分子中只要含有两个或两个以上酰胺键的化合物就能发生这种颜色反应。由于蛋白质分子中含有许多与双缩脲结构相似的肽键（-CO-NH-)，因此，蛋白质的肽键在碱性溶液中能与Cu2+产生紫色的络合物，且颜色深浅与蛋白质浓度成正比。先单独加入NaOH溶液是为了营造一个碱性环境。如果事先将双缩脲试剂A与双缩脲试剂B混合，那么就会产生Cu(OH)2沉淀而失去作用，看不到效果。此外，加入的双缩脲试剂B液也不能过量，否则蓝色过多会遮盖产生的紫色。

3核酸鉴定用试剂

3.1二苯胺试剂二苯胺试剂用于鉴定DNA。

3.1.1配置方法

A液：1.5g二苯胺（C12H11N）溶于100mL冰醋酸（C2H402)中，再加1.5mL浓硫酸。保存和使用均用棕色瓶，因为其在光下可以被分解，也可以放入冰箱中保存6个月。如冰醋酸呈结晶状态，则需加温后待其熔化后再使用。B液：体积分数为0.2%的乙醛溶液（C2H40)。

3.1.2使用方法

使用时现配现用，将0.1mLB液加入10mLA液（使用前在室温下摇匀）中就可以配置成二苯胺试剂。将配置好的二苯胺试剂加入到待测溶液中，并进行沸水浴加热。

3.1.3实验现象

二苯胺试剂鉴定DNA，沸水浴加热后溶液呈浅蓝色。

3.1.4作用原理

DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物。蓝色深浅与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。

3.2苔黑酚-乙醇溶液 常用于鉴定RNA。

3.2.1配置方法

溶解6g苔黑酚于100mL95%乙醇中（可在冰箱中保存1个月）。三氯化铁浓盐溶液，将2mL10%三氯化铁（FeCl3·6H20)溶液加入400ml浓HCl。

3.2.2使用方法

取RNA水解液lmL，三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚-乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中l0min。

3.2.3实验现象

RNA在上述沸水浴加热lOmin后溶液变成绿色。

3.2.4作用原理

核糖核酸（RNA）中含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分，加硫酸煮沸可使其水解，制成水解液。在酸性条件下，RNA分子中的核糖基可转变为α-呋喃甲醛，可以与苔黑酚作用生成绿色复合物，此复合物颜色的深浅与其浓度有关。

4脂肪鉴定用试剂

鉴定脂肪的试剂为苏丹Ⅲ或Ⅳ试剂。

4.1配置方法

将苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ干粉0.lg溶于10mL 95%洒精中，过滤后再加入l0mL甘油完成配置。

4.2使用方法

先将用于鉴定脂肪的实验材料（最好选择富含脂肪的种子，如花生种子）制作成切片。供实验用的花生种子，必须提前浸泡3~4h，浸泡时间短了，不容易切成片；浸泡时间过长，则组织太软，切下的薄片不易成形。然后用滴管滴加2~3滴苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染液，染色1~2min后用吸水纸吸去染液，并滴加1~2滴50%的洒精洗去浮色再吸去洒精。最后滴加1~2滴蒸馏水后盖上盖玻片在显微镜下观察。

4.3实验现象

显微镜下观察经过处理后的切片，可看到苏丹Ⅲ染液遇脂肪的颜色反应为橘黄色，苏丹Ⅳ染液遇脂肪的颜色反应为红色。

4.4作用原理

苏丹Ⅲ或Ⅳ在脂肪中的溶解度比在洒精中的溶解度大，当用苏丹Ⅲ或Ⅲ的洒精溶液处理含有脂肪的生物组织时，酒精中的苏丹Ⅱ或Ⅲ进入脂肪中，将脂肪染成橘黄色或红色。因苏丹Ⅳ染液与脂肪的亲和力比较强，所以，染色的时间应比较短，一般为lmin左右。由于脂肪可溶于酒精中，所以染色脂肪时间不能过长，一般不得超过lOmin。

5 CO2鉴定用试剂

鉴定CO2常使用溴麝香草酚蓝水溶液或者用石灰水。

5.1溴麝香草酚蓝水溶液

配置方法溴麝香草酚蓝水溶液简称为BTB，配置方法是将lg溴麝香草酚蓝加入l000mL20%酒精溶液中。

5.2使用方法

在鉴定CO2时，在BTB试剂中通入气体后观察溶液颜色变化，其精度比石灰水高，而且没有SO2的干扰。

5.3实验现象

CO2可使澄清石灰水变浑浊，而使BTB试剂由蓝色→绿色→黄色。

5.4作用原理

BTB试剂是一种酸碱指示剂，其在弱碱性溶液中呈蓝色，在弱酸性溶液中呈黄色。普通水是中性，加入0.1%BTB溶液的水一般呈现蓝色。当溶有CO2后，由于形成碳酸，因此溶液就会由蓝色变为黄色。当中过渡颜色是绿色。

6乙醇鉴定用试剂

6.1重铬酸钾配置方法

将重铬酸钾60g研细，研磨过程中扬起的重铬酸钾粉末有害健康要注意。然后将其溶解在300mL6(n：温水中。搅拌下直接少量多次加入工业硫酸(98%)，每次加入量小于10mL，共加入浓硫酸460mL。反应温度控制在小于90℃。温度太高，水会蒸发损失。配制好的溶液呈红色，并可能有均匀的红色Cr03小结晶。

6.2使用方法

将待测样品加入硫酸酸化的重铬酸钾溶液中，振荡观察溶液颜色变化。

6.3实验现象

液体里面含有乙醇，加入用硫酸酸化的重络酸钟后，颜色由澄色→灰绿色。

6.4作用原理

用硫酸酸化处理的重铬酸钾检测洒精，是因为Cr6+能被酒精还原为Cr3+，颜色发生变化，而且含量越多一般颜色越深，橙黄→灰绿，所以可根据颜色的变化来判断是否含有洒精。酸性重铬酸钾有强氧化性，一般用硫酸酸化而不能用盐酸，因为高价的Cr会氧化氯离子。同样的原理，也可以使用硫酸酸化的高锰酸钾溶液检测乙醇，颜色则由紫色变成无色。

7其他几种染色试剂

除上述几种试剂以外，在高中生物学实验中还有一些显色反应，常用于细胞结构的观察。

7.1甲基绿-派洛宁染液

细胞核被染成绿色，而细胞质被染成红色。因此证明DNA主要分布在细胞核内，而RNA则主要分布在细胞质中。

龙胆紫和醋酸洋红染液细胞核内的染色质（体）进行染色处理后分别被染成紫色或红色。

7.2健那绿染液

健那绿是细胞线粒体的活性染色剂，因线粒体中细胞色素氧化酶能使染料保持氧化状态（即有色状态），所以呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料则被还原成为无色状态。

7.3亚甲基蓝染液

用于检测好氧细菌，由于好氧细菌能进行有氧呼吸而产生CO2，使环境变为弱酸性，进而使亚甲基蓝由氧化态的蓝色变成还原态的无色。

——樊晓鸣.高中生物学实验中的物质鉴定方法归纳.生物学教学.2011年第11期

鲸鱼在天上飞

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