如何利用重组大肠杆菌生产人胰岛素？

秦四哥

                              

1问题背景

人胰岛素是一种由两条多肽链(A链和B链)组成的蛋白质。胰岛素合成时，最初在胰岛B细胞内的附着核糖体上形成的是一条单链多肽———前胰岛素原，其进入内质网腔后，信号肽酶切除信号肽形成胰岛素原，后者被运输至高尔基体，在高尔基体中切除连接序列(C链)形成A链和B链，然后通过二硫键将两者结合形成有生物活性的胰岛素。

综上可知，在真核细胞中合成胰岛素需要内质网和高尔基体参与加工，才能获得有生物活性的胰岛素，最后通过高尔基体形成小泡将其分泌到细胞外。而原核细胞中没有对蛋白质进行加工修饰的细胞器，那么如何利用基因工程在大肠杆菌中合成有生物活性的胰岛素呢?下面就此问题作简要分析。

2产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略

长期以来已发展了多种大肠杆菌工程菌，但是有代表性的构建方案主要有下列三种。

2.1 AB链分别表达法

该方法在早期重组大肠杆菌生产胰岛素时采用。A链和B链的基因编码区(不含内含子)由化学合成并分别克隆在β－半乳糖苷酶基因的表达型质粒上，后者与胰岛素编码序列形成杂合基因，其连接位点处为甲硫氨酸密码子。重组分子分别转化大肠杆菌受体细胞，两种克隆菌分别合成β－半乳糖苷酶－人胰岛素A链融合蛋白以及β－半乳糖苷酶－人胰岛素B链融合蛋白。经大规模发酵后，从菌体中分离纯化融合蛋白，再用溴化氰在甲硫氨酸残基的C端以化学方法切断融合蛋白，释放出人胰岛素的A链和B链。由于β－半乳糖苷酶中含有多个甲硫氨酸残基，溴化氰处理后生成多个小分子多肽，而A链和B链内部均不含甲硫氨酸残基，故不被溴化氰继续降解。A链和B链进一步纯化后，以2∶1的分子比混合，并进行体外化学折叠。

2.2人胰岛素原表达法

将人胰岛素原cDNA编码序列克隆在β－半乳糖苷酶基因的下游，两个DNA片段的连接处仍为甲硫氨酸密码子。该杂合基因在大肠杆菌中高效表达后，分离纯化融合蛋白，并同样采用溴化氰特性化学裂解法回收人胰岛素原片段，然后将之进行体外折叠。由于C链的存在，胰岛素原在复性条件下能形成天然的空间构象，为三对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得体外折叠率高达80%以上。为了获得具有生物活性的胰岛素，经折叠后的人胰岛素原分子必须用胰蛋白酶特异性切除C链。胰蛋白酶的作用位点位于精氨酸或赖氨酸残基的羧基端，由于天然构象的存在，人胰岛素原链第22位上的精氨酸残基和第29位上的赖氨酸残基对胰蛋白酶的作用均不敏感。因此用胰蛋白酶处理人胰岛素原后，可获得完整的A链以及C末端带有精氨酸残基的B链。也就是说，与人的天然胰岛素相比，这个B链多出一个氨基酸残基，后者再用高浓度的羧肽酶B专一性切除。

2.3 AB链同时表达法

该方法的基本思路是将人胰岛素的A链和B链的基因编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋白经溴化氰处理后，分离纯化A－B链多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸残基性质，采用相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。与AB链分别表达法相似，其最大的缺陷仍是体外折叠的正确率较低。

——胡文斌.如何利用重组大肠杆菌生产人胰岛素.生物学教学.2013年第3期（节选）