PCR引物的设计原则

秦四哥

                              

尽管有很多因素可影响PCR扩增反应的效率与特异性，但最关键的因素要数引物的设计。引物设计的首要目标是其特异性，只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列退火形成稳定的结构时才能达到这个目的。

引物设计主要遵循如下原则:

①引物的长度一般在18～25b，太短则特异性不够强;太长则退火温度会比较高。

②引物G+C含量以40%～60%为宜，太少扩增效果不佳;过多则易出现非特异条带。4种碱基最好随机分布。

③两条引物之间不能有连续4个碱基的互补配对，否则加入的引物自身形成双链而得不到目的基因片段。

④一条引物自身不能有大于4b的反向重复序列或自身互补序列的存在，这种序列可形成发夹结构。如果这种结构在PCR条件下稳定，它会非常有效地阻止引物和模板之间的退火。

⑤两条引物的退火温度相差不能大于5℃。如果相差太大，操作时一般选择较低的那个退火温度，那么另一条引物的非特异性结合就会增加。

⑥引物3’端的性质非常关键，如果可能的话，最末及倒数第二个碱基的最佳选择是G和C。

⑦实际应用中最重要的一点，设计的引物在合成之前，有必要在DNA数据库中进行BLAST检测，以确保引物中的序列只在所扩增的基因中出现，而与其他基因不具有互补性。

——沈静丹.浅谈PCR技术.生物学教学.2014年第2期