对基因工程教学中相关问题的探讨

秦四哥

1如何从基因文库中获取目的基因

教材中有这样的描述：“根据目的基因的有关信息，如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因”。到底怎样根据这些信息获取目的基因呢？

1.1根据基因的核苷酸序列

方法之一是核酸杂交筛选法，具体步骤为：①将基因文库菌落转移至硝酸纤维膜上，其位置和培养皿上完全对应：经处理，使蛋白质消解、DNA变性成单链并固定于膜上；②根据已知目的基因的核苷酸序列制备杂交用的探针，常采用的探针是经放射性同位素标记的序列已知的与待获取的目的基因互补的单链DNA；③将膜和探针混合，使放射性探针与膜上互补DNA杂交；④将X光片放膜上，进行放射自显影，经冲洗，有放射性的部位X光片上会出现黑斑；⑤在培养基中找出和X光片上的黑斑相对应的菌落，从该菌落中提取目的基因即可。

筛选法是目前应用更为广泛的方法，根据已知目的基因两端的序列，设计引物，以菌落或菌落中提取出的质粒DNA为模板进行PCR扩增，通过对PCR产物进行电泳分析后测序，若能得到预期长度的产物，则该菌落中就可能含有目的基因。

1.2根据基因的功能

根据基因的功能，设定相应的筛选条件，筛选文库，分离得到相应性状的克隆。另外到数据库中搜索其他序列已知的生物中具有同种功能的基因的序列，分析出这些基因的保守区域后根据该保守区域，设计引物并进行PCR扩增，产物测序后，根据测序结果再设计RACE引物，继续PCR；产物测序；拼接测序结果，直至得到完整的目的基因序列，最后通过遗传转化实验验证目的基因的功能，排除假阳性。

1.3根据基因在染色体上的位置

根据基因在染色体上的位置这一信息从文库中分离目的基因较为复杂，可用图位克隆（又称定位克隆）的方法。具体方法是：在目的基因两侧确定一对紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。接着，利用最紧密连锁的一对两侧分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个分子标记之间的含目的基因的特定的基因组片段克隆并分离出来，再通过遗传转化实验验证目的基因的功能。

1.4根据基因的转录产物mRNA

利用分离到的基因的转录产物mRNA；反转录得到cDNA用放射性同位素标记成探针后，进行杂交，方法同核酸杂交筛选法或以该cDNA信息设计引物，进行PCR扩增。

1.5根据基因的表达产物蛋白质

应用蛋白质测序技术测定其氨基酸序列，并根据特定物种中已知蛋白质的密码子使用频率及最可能在目的基因中出现的密码子资料，选择含有密码子简并程度最低的蛋白质区段来推测编码该蛋白质的核苷酸序列，以此合成一段寡核苷酸片段作为探针，从cDNA文库或基因组文库中筛选目的基因。也可根据此核苷酸片段设计引物，进行PCR扩增。还可将分离纯化的蛋白质作为抗原，免疫动物制备相应的抗体，若用放射性同位素标记该抗体，则可根据抗体-抗原特异性结合的原理，通过观察放射性标记即可找到产生该抗原的基因，即目的基因。

2体内DNA复制与PCR相关条件的比较

2.1模板

体内DNA复制是以整个DNA分子为模板，PCR则以一段目的DNA片段为模板。

2.2原料

人教版生物必修二《DNA的复制》一节中提到“利用细胞中游离的4种脱氧核苷酸为原料”进行DNA的复制，而选修三PCR中所需原料却是4种脱氧核苷三磷酸（dNTP)；即腺嘌呤脱氧核苷三磷酸(dATP)、鸟嘌呤脱氧核苷三磷酸（dGTP)、胞嘧啶脱氧核苷三磷酸(dCTP)、胸腺嘧啶脱氧核苷三磷酸（dTTP)。对此，学生不禁要问：为什么同样是DNA的复制，原料却不同呢？事实上，直接参与体内DNA复制的就是脱氧核苷三磷酸（dNTP)；在DNA聚合酶作用下，引物或已合成的脱氧核苷酸链末端的3'-0H会对另一新来的脱氧核苷三磷酸的α-磷原子发生亲核攻击，从而形成3',5'-磷酸二酯键并释放出焦磷酸(PPi)。在此过程中，形成磷酸二酯键所需能量来自α与β磷酸基团之间高能磷酸键的水解。体内DNA复制时，脱氧核苷酸在磷酸激酶的作用下接受ATP提供的磷酸基团，可转化为脱氧核苷三磷酸，从而直接参与DNA复制。所以两者并不矛盾。

2.3能量

体内DNA复制过程中，DNA双链模板解旋成单链及脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成都需要ATP供能；PCR中虽然不需要ATP，但也需要能量，其中DNA双链解旋成单链过程中所需的能量是通过仪的温度升高到94℃，即加热实现的。如前2.2所述磷酸二酯键的形成所需能量来自α与β磷酸基团之间高能磷酸键的水解。

2.4引物

体内DNA复制和PCR都需要引物，必修二《DNA的复制》一节中为便于学生理解DNA复制过程而并未提及引物，实际上体内DNA复制时，先由RNA聚合酶在DNA模板链上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶开始催化合成新的DNA链。PCR中的引物是指与待扩增的目的基因的两端序列互补的人工合成的单链DNA片段，包括引物Ⅰ和引物Ⅱ，即上游引物和下游引物。

2.5酶

体内DNA复制中，DNA双链模板解旋成单链需要解旋酶，引物的合成需要RNA聚合酶，延伸需要DNA聚合酶，冈崎片段的连接需要DNA连接酶。而PCR只需要热稳定的DNA聚合酶，即Taq酶。

3农杆菌对单子叶植物的侵染能力

农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤部位会产生一些诸如乙酰丁香酮等的酚类物质以吸引根瘤农杆菌向受伤组织靠拢。研究表明，这些物质主要在双子叶植物的细胞壁中合成，往往不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来研究发现，某些种类的农杆菌对单子叶植物也有侵染能力，在实际操作中，为了提高转化的成功率，通常会加入乙酰丁香酮等酚类物质。

4大肠杆菌如何生产出有活性的胰岛素

胰岛素是分泌蛋白，在真核生物的核糖体上合成的多肽需要内质网、高尔基体的加工才能形成有活性的胰岛素。而大肠杆菌是原核生物，其细胞中无内质网和高尔基体，因此在大肠杆菌中合成的胰岛素其实是无活性的胰岛素原，需要在体外进一步加工才可。目前常采用的策略是将胰岛素基因与大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因拼接，所产生的融合型重组蛋白不能分泌，主要以包涵体形式存在于细胞内，通过对肽链进行分离、纯化、体外折叠，即可获得有生物活性的胰岛素。

——张芸.对基因工程教学中相关问题的探讨.生物学教学.2015年第10期