对以海藻酸钠为载体的酵母细胞固定化实验的解读

秦四哥

                              

酵母细胞固定化是将活酵母细胞高度密集于载体上，并不断地进行生长繁殖，形成高浓度的生物催化剂，从而大大加快反应速度，使反应器生产能力大幅度提高的一项现代生物工程技术。细胞固定化常用方法有载体结合法、交联法和包埋法等。其中，包埋法是最常用的一种方法，其利用多孔性载体、凝胶网格结构或半透性薄膜将细胞包裹起来，使得小分子底物和产物可以自由进出，而细胞却不会扩散到周围介质中去。包埋细胞首先要选择合适的包埋载体，对载体的要求主要有：固定化过程简单，易于成型，对微生物无毒性，物理、化学稳定性好，不易被分解等。

在人教版高中生物学教材选修1中，明确用包埋法固定细胞常用的有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等不溶于水的多孔性载体。而在教材中又提到“海藻酸钠在水中溶解的速度较慢”。学生对此易产生疑惑：海藻酸钠是可以溶于水的，那么它又为何能成为细胞固定化载体呢？

1氯化钙在固定化细胞形成中的作用

海藻酸钠微溶于水，是一种无生物毒性的亲水性物质。分子式为[C6H706Na]n，由β-D-甘露糖醛酸（简称M单元）和α-L-古罗糖醛酸（简称G单元）两种结构单元构成。这两种结构单元以三种方式（MM段、GG段和MG段）通过α-1,4糖苷键链接，聚合形成一种无支链的线性嵌段共聚物（图1）。

海藻酸钠粉末遇水后通过水合作用迅速粘合在一起形成黏性团块，然后缓慢地完全水化并溶解形成黏稠状胶体溶液。将其加入氯化钙溶液中后，海藻酸钠G单元中一价钠离子与溶液中二价钙离子在羧基部位迅速进行离子交换，随后钙离子将两侧海藻酸分子链上的羧酸基团相连从而形成交联。并且G单元能与Ca2+络合形成独特的蛋盒（egg-box）结构（图2），最终形成多孔隙网络空间的海藻酸钙凝胶结构。海藻酸钙不溶于水，能够将细胞固定并具有一定的机械强度。从上面的过程中可以看出，CaCl2起的是交联剂的作用，教材中提到的水溶性海藻酸钠是一种良好的包埋载体，与酵母细胞混合后遇到钙离子才完成细胞的固定化，形成不溶于水的多孔性载体。实际上除钙离子外，水溶性的海藻酸钠可以通过大多数多价阳离子（镁、汞除外）交联形成海藻酸盐凝胶。

从海藻酸钙凝胶形成的机制来看，钙离子是决定凝胶珠机械强度的重要因素。如果钙离子浓度过低，与钠离子的交换速度缓慢会导致交联程度不够，固定化细胞机械强度低。随着钙离子浓度的增加，固定化细胞的机械强度也逐步增强。但过高浓度的CaCl2能引起细胞脱水，致使微生物活性部分丧失。另外，氯化钙浓度过高会在凝胶的表面迅速形成致密的交联结构，阻碍了Ca2+向凝胶内部的扩散，使得内部不能形成完整的凝胶结构。因此，选择合适的CaCl2浓度对实验的成败是很重要的。

2海藻酸钠浓度是影响固定化细胞性能的关键因素

海藻酸钠浓度既关系到固定化细胞的机械强度，也决定了固定化细胞的反应性能。当钙离子浓度一定时，如果海藻酸钠的浓度过低，海藻酸钠与钙离子交换不完全，形成的凝胶体强度小，易破裂。同时，由于凝胶网络不够致密，包埋的细胞数目偏少而影响反应效果。随着海藻酸钠浓度的增大，离子交换更加充分，形成的海藻酸钙空间网络结构更致密，同时海藻酸钠大分子彼此间的相互作用加强，其持水能力、弹韧性及凝胶强度都逐渐增强i。但如果海藻酸钠浓度过高会导致溶液粘性增加，给固定化操作带来不便。另外，随着海藻酸钠浓度的递增，海藻酸钠分子之间相互接触更加紧密，彼此间链段缠结更紧，Ca2+反而难以与之交换形成凝胶珠。

因此，要选择合适的海藻酸钠浓度，使凝胶既具有一定的强度，又保持相对较高的渗透性，这样才有利于底物的进入和产物排出，有利于固定化细胞充分发挥作用。

3交联时间影响固定化细胞的质量和活性

海藻酸钠在CaCl2溶液中交联的时间越长，离子交换的越彻底，形成的固定化凝胶小球的强度就越高。但是，同时凝胶小球内部的结构也变得更加紧密，影响营养物质和代谢废物的传递，导致固定化细胞死亡。因此，实验操作中要根据需要选择合适的固化时间：既保证凝胶小球的强度，又保证固定化细胞的活性。实际操作中，固定化时间从几十分钟到几十小时不等，大量实验表明海藻酸钠固定微生物细胞比较合适的交联时间为18h。

4温度对凝胶小球性能的影响

将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入活化的酵母细胞，充分搅拌混合后滴加到CaCl2溶液中。这样做的目的是防止高温使酵母菌死亡。但冷却的温度也不能过低，否则海藻酸钠溶液会发生凝固。实验表明：温度在40℃~60℃时形成的海藻酸钙凝胶特性最好，温度降低和升高，凝胶特性都变差。这是因为适当地提高温度能使海藻酸钠分子间链段的缠绕得到一定的舒展，有利于与钙离子结合成网状结构。但是随着温度继续升高，海藻酸钠分子中的G、M段容易分开，就不易于和钙离子形成网络结构，从而导致凝胶特性变差。实验操作过程中最好选择既不影响酵母菌存活，又有利于凝胶形成的温度。

5细胞活性与凝胶小球直径的关系

凝胶小球直径越小，小球内外之间的物质交换越充分。直径太大则会造成凝胶小球内部的细胞营养供给不足，积累的代谢废物难以排出，导致固定化细胞因凝胶小球内部环境恶化而死亡。实验中利用注射器将海藻酸钠溶液滴加到CaCl2溶液中，应根据实验需求通过注射器型号控制合适的胶球直径。

综上所述，氯化钙浓度、海藻酸钠浓度能显著影响固定化细胞凝胶小球的机械强度和性能，所以要选择合适的钙和钠比率，控制好一定的温度才能制得强度合适、反应性能好的凝胶小球。

——侯松涛.吴志强.对以海藻酸钠为载体的酵母细胞固定化实验的解读.生物学教学.2015年第12期