也谈核移植技术中的几个问题

苗述生物

   获得克隆动物的方法有胚胎分割、孤雌生殖和细胞核移植等。其中，细胞核移植是指将早期胚胎细胞、胎儿细胞或成体动物的细胞核移植到去核的卵母细胞中，重新组成重构胚或克隆胚并使之发育成成体动物的过程。

1.供体细胞和受体细胞：

   提供细胞核的细胞称为核供体，接受细胞核的细胞称为核受体。核供体：胚胎细胞、胎儿细胞、体细胞，其中胚胎细胞核移植的成功率远高于体细胞；核受体：早期胚胎细胞、受精卵、MII期卵母细胞。早期核移植技术中常用受精卵，后来基本上用MII期卵母细胞取代了受精卵，主要因为两者的细胞质环境不同。有人认为重组需要的因子存在于MII期卵母细胞的胞质中，而在原核形成时这些因子已被降解或用光，因此，原核扩张后受精卵去核可引起胞质中重组因子缺乏。成熟促进因子（MPF）是卵母细胞细胞质中重要的胞质影响因子，MPF的活性在卵母细胞减数分裂的MI期和MII期达到最高，受精或激活后，MPF迅速灭活，因此，MII期卵母细胞中MPF活性高，而受精卵中MPF活性低。MPF水平的高低可影响供体核染色质的状态和复制。MII期卵母细胞细胞核、细胞质已成熟，而MI卵母细胞细胞核、细胞质尚未成熟，其细胞质不能支持胚胎的全程发育，因此，尽管MI期卵母细胞MPF活性也高，但不能用作受体卵母细胞。

   也有人认为用去核合子做受体时，可能由于合子去核时一些早期发育必需的因子随原核的去除而被去掉了，而使去核受精卵缺乏发育能力。因此，目前广泛采用MII期卵母细胞做受体。

    根据供体细胞与受体细胞是否来源于同一种动物又可将其分为同种核移植和异种核移植。

2.核移植的机理：

   供体细胞的细胞核移入卵母细胞后，在卵母细胞相关因子的作用下，发生核DNA重新编排回复到发育的起点状态。核重编程的过程就是使在体细胞中被关闭，而在正常胚胎发育中表达的基因重新被激活的过程。重编程可能有三种结果：供核基因组完全没有进行重编程重构胚很快死亡；部分重编程，重构胚在不同的发育阶段死亡；完全重编程，产生正常的克隆动物。

3.核移植的操作过程：

（1）受体细胞去核方法：

   盲吸法：也就是浙科版教材36页中所谓的“吸出”，即在第一极体排出后不久，染色体位于极体附近，用显微去核针吸去极体附近的细胞质就可以除去细胞核；

   功能性去核法：也就是浙科版教材中34、35页中所谓“用紫外线破坏”，即用Hoechst 33342染色，然后紫外线照射核区，使核失去功能；

   半卵法：将卵母细胞切成两半，拿无核一半作为受体；

  此外，还有荧光引导核法、微分干涉显微镜去核法、离心去核法、化学试剂去核法等。

（2）供体细胞的准备：

    供体细胞和受体细胞的细胞周期对核移植胚胎的发育率具有重要影响，细胞周期调控的具体操作方法苗老师已另文阐述——说说“营养限制性培养”，此处不再重复。

（3）核的植入：

    常用的核移植方法有两种：胞质内注射和透明带下注射。胞质内注射是用一个外径5-8μm的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法；透明带下注射则是把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。

（4）胚激活：

   浙科版教材52页提到核移植形成重组细胞后还需要“经过胚激活、胚胎培养、胚胎移植后直接由受体完成克隆动物”。胚激活是什么意思，为什么要胚激活？

    正常情况下，受精过程中，精子进入卵子后，卵母细胞质中会出现一系列的反应，如游离钙离子浓度增高、母源性的mRNA启动转录、MPF等因子活性下降等。这些反应是卵母细胞被激活的标志，不经过这些变化，胚胎就不能正常发育。核移植过程中的胚激活就是模仿受精过程中精子的刺激作用。目前，激活的方式有电激活、化学激活和注射精子因子激活三种。化学激活常用药品有：钙离子载体（A23187）、7%乙醇、离子霉素、6-DMAPSrCl2。