与基因工程有关的一些概念之辨析

秦四哥

1启动子、起始密码和复制原点

启动子：是基因的一个组成部分，其化学本质是DNA的部分序列，控制基因转录的起始时间和基因表达的程度。启动子就像“开关”，决定基因的活动。启动子存在于基因编码区上游的非编码区，是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。在启动子上有与RNA聚合酶结合的位点。

起始密码子：碱基顺序作为遗传信息而被正确翻译通常需要从某个特定的位置开始翻译，这个起始点的密码子就叫做起始密码子。起始密码子由mRNA上相邻的3个碱基组成，从这3个碱基开始决定蛋白质合成。蛋白质是由许多氨基酸组成的，而组成蛋白质的第一个氨基酸就是由起始密码子决定的。真核生物的起始密码子AUG翻译对应的是甲硫氨酸。少数细菌（属于原核生物）以GUG（缬氨酸）为起始密码。

复制原点：DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。DNA的复制是由许多复制原点处形成的起始复制叉开始的。多个复制原点及由复制原点开始向DNA两端同时复制，都有利于加快DNA复制速度。

2终止子和终止密码

终止子：是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列（存在于基因的编码区下游的非编码区）。终止子可分为两类：一类不依赖于蛋白辅助因子就能实现终止作用；另一类则需依赖蛋白辅助因子才能实现终止作用。

终止密码：是指蛋白质翻译过程中终止肽链合成的mRNA的三联体碱基序列。在已知的64组密码子中，有3组不编码任何氨基酸，而是专司终止多肽合成，它们分别是UAG、UAA和UGA。

3 DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶和DNA连接酶

DNA聚合酶：是细胞进行DNA复制过程中起主要作用的酶。以DNA为模板，DNA聚合酶负责把一个个脱氧核苷酸通过脱水缩合的方式连接在一起。复制方向是由DNA的5'端到3'端，即DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核酸片段的1末端的羟基上，形成磷酸二酯键。

TaqDNA聚合酶：由一种水生热菌yT1株分离提取出来，是迄今发现的耐热DNA聚合酶中活性最高的一种。

DNA连接酶：DNA复制过程中，DNA连接酶的作用是催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键（而不是在单个脱氧核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键）。在构建重组DNA时（将合成好的一些DNA单链小片段连接在一起）也会使用DNA连接酶。

4限制酶和解旋酶

限制性核酸内切酶：是指可以识别DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。限制酶的识别序列一般为4~6个碱基，也有8个碱基的。每一种限制酶都有自己特定的作用位点，切割点是DNA单链上的磷酸二酯键。如果切割位点的DNA的两条单链上识别序列（4~8个碱基）从5'端阅读时是完全一样的，这种结构叫做“回文”结构。酶切回文序列后，如果在双链DNA上形成切口错开的两个末端，称为黏性末端。

解旋酶：是指一类解开氢键的酶，而不是单一的一种酶。解旋酶需要ATP供给能量来解开DNA的氢键。

5膜载体和运载体

膜载体：是存在于生物膜内负责各种溶质分子穿膜转运的载体蛋白，有助于完成协助扩散和主动转运。

运载体：指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（一般指目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三类最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。但是，并非所有质粒都可以作为运载体，作为运载体的质粒需要具备以下特点：多个酶切位点、对受体细胞没有危害并易于分离、能自我复制并稳定保存、具有特殊的标记基因等。另外，还可利用运载体在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆）。

6质粒和环状DNA

质粒：存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的小型环状DNA分子。

环状DNA：有环状单链DNA和环状双链DNA，可存在于病毒、细菌中，也存在真核生物的线粒体和叶绿体中。环状DNA—般比线性DNA结合更紧密、更稳定，储存的遗传信息更多。原核细胞中构成拟核的就是环状DNA。

7 PCR与DNA复制

聚合酶链式反应（PCR)：是一种用于扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。过程是：变性（体外95℃高温时DNA变性变成单链）→加引物（经常是60℃左右，引物与单链按碱基互补配对的原则结合。引物为DNA片段）→延伸（72℃左右，DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖即5'-3'的方向合成互补链）。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度、复性温度、延伸温度之间很好地进行控制。

DNA复制：是指DNA双链在细胞分裂以前进行的复制过程，复制的结果是一条双链变成两条一样的双链（如果复制过程正常的话），每条双链都与原来的双链一样。这个过程是通过半保留复制的机制来得以顺利完成的。已知DNA聚合酶合成方向均为5'—3'方向，因此每一个复制叉（DNA解旋后形成的“Y”状结构）只有一条链能按正确方向指导新链从头到尾合成;另一条链就只能一段一段（称为冈崎片段）复制后再在DNA连接酶作用下连接起来。细胞内DNA复制与PCR不同之处：一是边解旋边复制，即DNA不是一下子变成两条单链，而是一边解旋一边复制，复制形成的新链再螺旋；二是细胞内DNA复制的引物为一段RNA链。

8 cDNA与DNA

cDNA：构成基因的双链DNA分子用一条单链作为模板，转录产生与其序列互补的mRNA分子。然后，在反转录酶的作用下，以mRNA分子为模板，合成一条与mRNA序列互补的单链DNA。最后，再以单链DNA为模板合成另一条与其互补的单链DNA,两条互补的单链DNA分子组成一个双链cDNA分子。真核生物的cDNA不等同于原基因，因为真核生物基因在转录产生mRNA时，一些不编码的序列即内含子被删除，保留的只是编码序列，即外显子。所以，真核生物cDNA序列都比原基因序列要短得多。cDNA属于DNA中的一类。

9目的基因与标记基因

目的基因：在基因工程中，把需要研究的基因（需要转移或改造的基因）称为目的基因，有时也称为插入基因。例如，抗虫基因、抗病基因、人的胰岛素基因、干扰素基因等。

标记基因：标记基因是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用。在基因工程中，它是重组DNA载体的重要标记，通常用来检验导入成功与否，以及用来定位细胞中的目的基因。例如，抗生素抗性基因、荧光素蛋白基因等。

10相邻碱基连接方式

相邻碱基有两种形式：一种是DNA双链中，相邻碱基是指配对的2个碱基，其连接方式是氢键，其中A-T之间是2个氢键，G-C之间为3个氢键；另一种是指DNA或RNA单链上的连接碱基，它们之间的连接方式是脱氧核糖（RNA为核糖）-磷酸-脱氧核糖(RNA为核糖）。

——陈卫东.与基因工程有关的一些概念之辨析.生物学教学.2016年第2期

半夏微凉

听君一席话  感受良多

Yoki

想请教下，如果目的基因在载入质粒时，连接反了会怎样？假设只用了一种限制酶，然后和原本连接方式倒过来了，目的基因还能正常被复制吗？

秦四哥

Yoki 发表于 2019-8-21 23:31
想请教下，如果目的基因在载入质粒时，连接反了会怎样？假设只用了一种限制酶，然后和原本连接方式倒过来了 ...

有复制原点就可以复制，但表达时的产物跟目标产物就不一样了。