选修1 专题5 课题3 蛋白质的提取和分离（电泳原理介绍）

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聚丙烯酰胺凝胶电泳

电泳（electrophoresis）是另一种有用的分离蛋白质的技术，它取决于带电分子在电场中迁移的能力。蛋白质的电泳分离通常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE），蛋白质在电流的驱动下通过凝胶基质，基质由有机小分子丙烯酰胺的多聚体组成，交联成分子筛。聚丙烯酰胺凝胶可以在两块薄玻璃板之间形成，也可以在玻璃管中形成。一旦凝胶聚合，将其悬挂在盛有缓冲溶液的两小室之间，每个小室各有一电极，极性相反。在板状凝胶中，将浓缩的蛋白样品点在凝胶上方的点样槽中（图18.28，步骤1）。在含有蔗糖或甘油的溶液中制备样品，蔗糖或甘油的密度防止样品与上方小室中的缓冲液混合。向两个装有缓冲液的小室施加电压，电流通过凝胶，使蛋白质向相反电极端移动（步骤2）。缓冲液一般是碱性的，使蛋白质带负电荷，向凝胶的另一端的带正电的阳极迁移。电泳完成后，从玻璃板上取下凝胶并染色（步骤3）。

蛋白质通过凝胶的迁移率依据分子的电荷密度（单位相对分子质量所带电荷）。电荷密度越大，驱动蛋白质通过凝胶的力越大，迁移率越大。但是电荷密度只是PAGE分离的重要因素之一，分子的大小和形状也起作用。聚丙烯酰胺形成交联的分子筛，阻碍蛋白质通过凝胶。分子越大，受到的阻力越大，迁移越慢。形状也是一个因素，相对分子质量相近的紧密球形分子比延伸的纤维状分子移动更快。用于制备凝胶的丙烯酰胺的浓度和交联剂也是重要因素。丙烯酰胺的浓度越低，凝胶的交联越少，特定蛋白质分子迁移越快。含5%丙烯酰胺的凝胶可用于分离6.0×104~2.5×105的蛋白质，而含15%丙烯酰胺的凝胶适于分离1.0×104~5.0×l04的分子。

观察带电的示踪染料监察电泳的进程，示踪染料正好迁移在移动最快的蛋白前面（图18.28步骤2）。

当示踪染料到达所期望的位置时，切断电流，从容器中取出凝胶。一般用考马斯亮蓝或银染染色凝胶，显示蛋白质的位置。假如蛋白质是通过放射标记，将凝胶压在X射线底片上，获得放射自显影照片。也可以将凝胶切开，直接分离各个蛋白。另外，凝胶上的蛋白质可通过第二次电泳转移到硝酸纤维膜上，形成印迹（见18.12节）。蛋白质被吸收到在纤维膜上的位置与凝胶上的位置对应。在Western印迹中，通过蛋白与特异抗体的相互作用确定在膜上的蛋白质。

SDS-PAGE PAGE一般在带负电荷的去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）存在时使用，SDS大量与各种蛋白质分子结合。结合的SDS分子间的静电斥力作用使蛋白质去折叠，形成相似的棒状结构，于是消除了一个分离因子：形状上的差异。与蛋白质结合的SDS的分子数大致与蛋白质的相对分子质量成正比（约1.4gSDS/g蛋白质）。所以，每种蛋白质分子，不论大小，有相等的电荷密度，受到的电场驱动力相同。然而，因为聚丙烯酰胺是高度交联的，大相对分子质量蛋白质比较小的蛋白质迁移时受到的阻力更大。结果，蛋白质在单个因素（相对分子质量）的影响下由SDS-PAGE分离。除了分离混合物中的蛋白质外，SDS-PAGE还可以根据标准蛋白质的电泳位置确定未知蛋白质的相对分子质量大小。在4.6节有SDS-PAGE应用的例子。

——本文选自《分子细胞生物学（第3版）》

原书名称《Cell andMolecular Biology》

[美]Gerald Karp著

王喜忠 丁明孝 张传茂 杨玉华 主译