血球计数板及其使用方法

秦四哥

                              

1血球计数板的构造

血球计数板是一种生物学或医学仪器，用以对人体血液中红细胞、白细胞进行显微计数，也常用于一些细菌、真菌、酵母菌等较大细胞或微生物的计数。

血球计数板的形状如图1所示，血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上由4个槽构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一方格网，每个方格网共分9个大方格（大方格用三线隔开），中央的一大方格作为计数用，称为计数室，如图2所示。

计数室的规格常有两种：一种叫希利格式（16×25型），是一个计数室分为16个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成25个小方格；另一种叫汤麦式（25×16型），是一个计数室分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。

但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数室都由400个小方格组成。计数室的边长常为1mm，则计数室的面积为1mm2，盖上盖玻片后，计数室的高度为0.1mm，所以每个计数室的容积为0.1mm3，每个小方格的边长为0.05mm，每个小方格的容积为1/4000mm3、16×25型的每个中方格的边长为0.25mm，每个中方格的容积为1/160mm3，25×16型的每个中方格的边长为0.2mm，每个中方格的容积为1/250mm3，如图3所示。

另外，有血球计数板规格为计数室边长为2mm，则计数室的面积为4mm2，计数室的高度为0.1mm，所以每个计数室的容积为0.4mm3，每个小方格的边长为0.1mm，每个小方格的容积为1/1000mm3。16×25型的每个中方格的边长为0.5mm，每个中方格的容积为1/40mm3；25×16型的每个中方格的边长为0.4mm，每个中方格的容积为2/125mm3。

2血球计数板的使用方法（以计数酵母菌为例）

(1)用血球计数板计数培养液中的酵母菌个数。

(2)样品稀释的目的是便于酵母菌的计数，以每小方格内含有4~5个酵母菌为宜，一般稀释10倍即可。

(3)将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室盖上专用的盖玻片。

(4)将稀释后的培养液，用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘，使菌液缓缓渗入，多余的菌液用吸水纸吸取，稍待片刻使酵母菌全部沉到计数室内。

(5)计数时，如果使用16×25型的计数室，要按对角线位，取左上，左下，右上，右下4个中方格（即100个小方格）的酵母菌个数3如果为25×16型的计数室，除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中方格（即80个小方格）的酵母菌个数。

(6)当遇到位于方格线上的酵母菌，采用样方法中“计上不计下，计左不计右”的计数原则，如图4所示。

(7)对每个样品计数3次，取其平均值，再按有关公式计算每毫升培养液中所含的酵母菌个数。

3血球计数板的计数公式

每个小方格的边长为0.05mm或0.1mm。绝大多数细菌的大小为0.5~5μm，酵母菌等真菌比细菌个体要大得多，一般为1~30μm。红细胞、白细胞的大小为10~15μm。故而使用血球计数板计数时，经常是测定每个小方格中细胞或微生物的数量，再换算成1mL培养液中细胞或微生物的数量。计算思路是运用标志重捕法中的局部与整体数据呈正比例的计算公式，即：（每个小方格中细胞或微生物的平均数×稀释倍数)/每个小方格的容积=1mL培养液中细胞或微生物的数量/103mm3，可以推算出不同规格的血球计数板的计数公式。

4适宜稀释倍数时的计数

在适宜的稀释倍数下，每个小方格中可以有4~5个细胞或微生物，是测定每个小方格中细胞或微生物的数量，故而与计数室的规格是16×25塑或25×16型无关。

(1)1mm×1mm计数室的计数

公式1培养液中细胞或微生物的数量/mL=每个小方格细胞或微生物平均数×稀释倍数×4×106

(2)2mm×2mm计数室的计数

公式2培养液中细胞或微生物的数量/mL=每个小方格细胞或微生物平均数×稀释倍数×106

5较大稀释倍数时的计数

当稀释倍数较大时，可能导致每个小方格内的细胞或微生物的数量过少，此时是测定每个中方格中细胞或微生物的数量，不同规格时每个中方格的容积不同，故而与计数室的规格是16×25型或25×16型有关，计算公式为：

（1）1mm×1mm，16×25型计数室的计数

公式3培养液中细胞或微生物的数量/mL=每个中方格细胞或微生物平均数×稀释倍数×1.6×105

（2）1mm×1mm，25×l6型计数室的计数

公式4培养液中细胞或微生物的数童/mL=每个中方格细胞或微生物平均数×稀释倍数×2.5×105

（3）2mm×2mm，16×25型计数室的计数

公式5培养液中细胞或微生物的数量/mL=每个中方格细胞或微生物平均数×稀释倍数×4×104

（4）2mm×2mm，25×16型计数室的计数

公式6培养液中细胞或微生物的数量/mL=每个中方格细胞或微生物平均数×稀释倍数×6.25×104

6实例

将样液稀释100倍，采用血球计数板（规格为1mm×1mm×0.1mm)计数，观察到的计数室细胞分布见图5，则培养液中藻细胞的密度是________个/mL。

运用公式4及采用五点取样法，取四角和最中间的5个中方格计数，采取“计上不计下，计左不计右”的原则处理，平均每个中方格内有4个酵母菌，则很容易计算出标准答案为1×108个/mL。

7使用血球计数板的不足之处

用血球计数板观察一定容积中的细胞或微生物数量，然后推算出含菌数，简便快捷。但是在计数时，包括死活细胞或微生物及微小杂物均被计算在内，这样得出结果往往偏高，因此适用于对形态个体较大的细胞或微生物进行计数。当然，结合染色法排除死细胞等的影响可以减小实验的误差。

——戎军.血球计数板及其使用方法.中学生物教学.2015年第10期（节选）