浅析生物学实验中颜色反应的原理

秦四哥

                              

——摘自浦仕奇《高中生物核心知识一本通》

“颜色反应”是鉴定一些化合物或结构的重要方法。相关试剂与待测样品的颜色反应大多是一些化学反应，也包含物理染色。人教版高中生物学教材中一共涉及13类颜色反应，本文对其理化原理进行分析。

1鉴定类的颜色反应

1.1淀粉的鉴定

淀粉中的淀粉链呈螺旋状，其中的葡萄糖基有羟基暴露在螺旋外部，碘与这些羟基作用，与6个葡萄糖基配合，然后嵌入淀粉螺旋体的轴心，形成包合物。包合物的吸光性能发生改变，当葡萄糖基小于6个时不呈色，当葡萄糖基平均为20个左右时呈红色，当葡萄糖基大于60个时呈蓝色。直链淀粉的淀粉链长，故而遇碘呈蓝色，支链淀粉的分支短，一般只有20~30个葡萄糖基，遇碘呈现蓝、红混合的紫红色。

1.2还原性糖的鉴定

斐林试剂由甲液（0.1g/mL的NaOH溶液）和乙液（0.05g/mL的CuSO4溶液）构成，两者混合后生成蓝色的Cu(0H)2沉淀。还原性糖中含还原性的醛基（-CHO)，在水浴加热的条件下，可将蓝色的Cu(OH)2沉淀还原成砖红色的CuO2沉淀(此处应该是Cu2O——秦四哥注)。因此，斐林试剂可以用来区分水溶性的醛和酮官能团，也可以对还原糖进行鉴定。

1.3蛋白质的鉴定

双缩脲试剂由A液（0.1g/mL的NaOH溶液）和B液（0.01g/mL的CuSO4溶液）构成。其中A液提供碱性环境，在碱性条件下，CuSO4溶液电离出的Cu2+与蛋白质中的肽键发生双缩脲反应，生成紫色络合物。所以，双缩脲试剂可用来鉴定蛋白质，现象为有紫色物质生成。

1.4脂肪的鉴定

苏丹染料在脂质中的溶解度大于有机溶剂，因此苏丹溶液中的染料分子与脂质的亲和力更强。依据溶解度的差异，可用苏丹溶液对脂肪进行染色，其作用原理主要是物理性脂溶和吸附作用。常用的苏丹试剂有苏丹Ⅲ和苏丹Ⅳ，前者可将脂肪染成橘黄色，后者可将脂肪染成红色。

1.5二氧化碳的鉴定

溴麝香草酚蓝是一种酸碱指示剂，颜色可随pH的变化而变化，变色范围为6.0~7.6(黄→绿→蓝）。CO2溶于水生成H2CO3，H2CO3水溶液呈弱酸性，所以用溴麝香草酚蓝鉴定呼吸作用释放的C02时，会出现颜色由蓝变绿再变黄的现象。

1.6酒精的鉴定

重铬酸钾在强酸（浓硫酸）环境下，可将乙醇（C2H5OH)氧化为乙醛（CH3CHO)，再进一步被氧化为乙酸（CH3COOH)，并生成硫酸铬（CrSO4)，CrSO4水溶液电离出Cr2+，Cr2+呈绿色。所以，酸性的重铬酸钾遇酒精会由橙红色变为灰绿色。

1.7亚硝酸盐的鉴定

亚硝酸盐在特定条件下可转化为亚硝胺，后者具有致癌和致畸作用。在泡菜的腌制初期，亚硝酸盐的含量会升高，因此要进行亚硝酸盐含量的测定。在盐酸提供酸性的条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮反应生成重氮盐，后者进一步与N-1-萘基乙二胺盐酸盐偶合形成玫瑰红复合物。将显色反应后的样品与标准溶液进行比较，可估算出亚硝酸盐的含量。

1.8 DNA的鉴定

在酸性条件下加热，DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖之间的糖苷键会发生断裂，生成嘌呤碱基、脱氧核糖和嘧啶碱基脱氧核苷酸，脱氧核糖进一步脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，该物质与二苯胺试剂反应可生成蓝色物质。

1.9分解尿素的细菌的鉴定

酚红是一种酸碱指示剂，当pH小于6.6时呈黄色，在6.6~8.0之间时呈橙色，高于8.4时呈红色。分解尿素的细菌可利用脲酶将尿素（CO(NH)2)水解成CO2和NH3，NH3溶于水呈碱性，可使酚红指示剂变成红色。

1.10分解纤维素的细菌的鉴定

分解纤维素的细菌，利用纤维素酶可将培养基平板上的纤维素降解成小分子糖，刚果红染色剂可以与大分子的纤维素牢固结合形成红色复合物，而不与小分子糖结合。用NaCl溶液冲洗平板后，小分子糖被洗脱下来。因此，在生长过分解纤维素的细菌的周围会形成透明圈。

2染色类的颜色反应

2.1甲基绿、吡罗红对DNA和RNA的染色

观察DNA和RNA在细胞中的分布实验，使用的是甲基绿-吡罗红混合染色剂。DNA和RNA分子都是多聚体，但聚合程度不同，甲基绿选择性地与细胞核中的聚合程度高的DNA结合，呈绿色；吡罗红选择性地与细胞质中的聚合程度较低的RNA结合，呈红色（解聚了的DNA也能和吡罗红结合呈红色）。所以，吡罗红对RNA的亲和力大，细胞质被染成红色；而甲基绿对DNA的亲和力大，细胞核被染成绿色。

2.2健那绿对线粒体的染色

健那绿是一种线粒体专一性活体染色剂，自然状态下呈绿色，具有脂溶性，能穿过细胞膜。健那绿中有染色能力的基团带正电，可与线粒体带负电的内膜结合，内膜上的细胞色素c氧化酶使健那绿保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中，被还原成无色状态。通过健那绿对细胞的染色，可以在高倍显微镜下观察活细胞中线粒体的形态和分布。

2.3碱性染色剂对染色体的染色

染色体在解螺旋状态下又称染色质，因易被碱性染料染成深色而得名。染色体自然状态下是无色的，对其观察和计数需要用染色剂染色，常用的碱性染色剂有醋酸洋红和龙胆紫溶液。碱性（或酸性）染色剂的界定并非由染料溶液的pH值决定的，而是根据染料物质中助色基团电离后所带的电荷来决定的。一般来说，助色基团带正电荷的染色剂为碱性染色剂；反之则为酸性染色剂。虽然龙胆紫染液的pH值为3.0,醋酸洋红染液的pH值为1.9,两者均为酸性溶液，但两者的助色基团带正电荷，所以是碱性染色剂，可对染色体进行染色。

——王子武.浅析生物学实验中颜色反应的原理.生物学教学.2016年第12期